要使ELISA试剂盒测定得到的作用，不论是定性的仍是定量的，有必要严峻依照规矩的方法制备试剂和施行测定。

首要试剂的制备要害已如前述，其他一般性试剂，如包被缓冲液、洗刷液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应中止液等，制作时不可漫不经心。

缓冲液可于冰箱中短期保存，运用前应查询是否蜕变。蒸馏水的质量在ELISA中也至关重要，运用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。

测定的施行中，应力求各个过程操作的标准化，下面以板式ELISA为例，介绍有关留心事项。

（一）ELISA实验加样

在ELISA中除了包被外，一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的性，例如规矩为加样一滴。此刻应该运用相同口径的滴管，坚持的加样姿势，使每滴液体的体积底子相同。在定量测定中则加样量应力求。

标本和结合物的稀释液应按规矩制作。加样时应将液体加在孔底，防止加在孔壁上部，并留心不可出现气泡。

（二）ELISA实验保温

在ELISA中一般有二次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，此刻反应的温度和时刻应按规矩的要求，保温容器是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不该叠在一同。为防止蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。

湿盒应该是金属的，传热简略。如用保温箱，空湿盒应预先放在其间，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。参与底物后，反应的时刻和温度一般不做严峻要求。如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时查询，待对看管显色适当时，即可中止酶反应。

（三）ELISA实验洗刷

洗刷在ELISA过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的要害。洗刷的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的烦扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。

因此在ELISA测定的反应过程中应尽量防止非特异性吸附，而在洗刷时又应把这种非特异性吸附的烦扰物质洗刷下来。在标本和结合物的稀释液和洗刷液中参与聚山梨酯（吐温，Tween）一类物质即右到达此目的。

聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常作为助溶剂。依据脂肪酸的品种而对聚山梨酯编号，结合月桂酸的为聚山梨酯20，在ELISA中zui为常用。它的洗刷作用好，并具有削减非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。

洗刷如不*，特别在zui后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。其他，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而发作烦扰。

ELISA板的洗刷一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗刷液注满板孔；③放置2min，略作摇摆；④吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗刷的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。

（四）ELISA实验比色

如阴性对照色彩极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。如用比色计测定作用，性决定于ELISA板底的平坦与透明度和比色计的质量。

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