ELISA检测体系可谓是免疫学反响应用到科研生产中*为广泛*为活络的技术手段。但是在新老手操作过程中总是会出现或大或小的问题，本人在刚开始做ELISA时就面对许多困难，比如说花板，假阳性，全显色，悉数显色，显色比空白还低,自己也为此苦恼过很长一段时间，跟着自己技术水平得进步，或多或少地也把握了ELISA体系的脾气，也是游刃有余吧，现在做方阵，做ELISA已是驾轻就熟了，以前检测一种抗体用整整一下午还算得晕晕的，现在给我十个八个的从包被到显色，一个作业日根本搞定。下面就由上海基免生物为你说明一下，做ELISA的经验总结:
1、包被原的性质很重要，蛋白浓度，是否降解，这到你做出的抗体可不可以被其辨认，所以保存抗原很重要，我做重组蛋白时，师兄都严厉警告我必定要在冰浴下缓慢消融就是这个道理。还有有的包被原可能不是蛋白，关于生物素和脂类物质或小分子物质咱们要事前对其改造再加以包被，我把办法简要的列出如下:①亲和素生物素:先亲和素先包被载体，参加生物素化的DNA，这种包被办法均匀、结实，已扩展应用于各种抗原物质的定量测定。②脂类物质:可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后参加ELISA板孔中，开盖置冰箱guo ye或凉风吹干，待酒精挥发后，让脂质天然干固在固相外表。③小分子必须依托和大的蛋白载体偶联后才干固定在固相载体上。
2、包被液的挑选，一般挑选ph9.6的碳酸盐缓冲液。但有时由于实验的需要，包被原的特殊性也可能选用中性的缓冲溶液来包。应留意以下原理：由于蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体外表的疏水基团间的作用，这种物理吸附对错特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响，大分子蛋白质较小分子蛋白质一般含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体外表。详细的实验还要有巩固的理论外也要实践，看一下*终可不可以应用到自己实验当中去。常用的包被液除了方才提到的pH9.6碳酸盐缓冲液，还有pH7.2的磷酸盐缓冲液和pH7-8的Tris-HCL缓冲液等等。
3、显色:显色体系又许多，咱们一开始做的时分，要挑选适合的显色体系。留意显色体系酶活性底物的保存HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠。
4、每次做尽量要把阴阳空三个对照做好，如出现问题也好剖析。
5、关闭：继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。关闭就是让很多不相关的蛋白质充填这些空地，从而排挤ELISA后的过程中搅扰物质的再吸附。常用关闭剂有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉，比较价廉，可以高浓度运用(5%-10%);还有一些稀有用到的各种动物血清(首要为了扫除类似蛋白搅扰)和酪蛋白等等。但*终选用什么，要根据实验详细来实践。
6、洗刷板：可以说在ELISA操作中，洗刷是*首要的关键技术。由于聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，为达到别离游离的和结合的酶符号物的意图，清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的搅扰物质，在洗刷时又应把这种非特异性吸附的搅扰物质洗刷下来。所以在洗板时会有必定差错，人为因素很大(当然有条件的用洗板机在外)，洗的不*或串了孔，对如此活络的ELISA体系但是不小的影响。
7、加抗体标本(和二抗):留意该换枪头时换枪头。标本稀释一般可用pbs稀释，也可用关闭液去稀释。如需加二抗，还要留意二抗的作业浓度，太高浪费，太低则着色浅。